目的：關(guān)節(jié)軟骨老化被認為是骨關(guān)節(jié)炎（OA）的主要危險因素，其中一部分可以通過晚期糖基化來解釋，該糖基化提供了交聯(lián)（例如戊四烯）在膠原分子內(nèi)的積累。這個過程導致組織的脆性和潛在的分解。此外，主要是金屬蛋白酶基質(zhì)蛋白（MMPs）的不可逆蛋白水解活性導致膠原纖維裂解，這也導致軟骨分解。以前的研究表明，分子和纖維形式以及角膜的機械拉伸可以保護膠原蛋白免受酶裂解。在這項研究中，我們研究了關(guān)節(jié)軟骨的膠原纖維拉伸對膠原酶酶活性以及非酶交聯(lián)活性的影響。
方法：采用兩個單獨的馬股骨髁提取相鄰的骨軟骨塞（直徑=8.5 mm）進行交聯(lián)（n=5）和酶促（n=6）實驗。解凍后，軟骨層被分成4個四分之一的圓盤，它們被滲透平衡（400 mOsm / kg水和4°C）約一小時。應用微壓痕（半徑～50 μm和剛度～50 N/m，Piuma，Optics11，荷蘭）獲得1.5*1.5 mm的平均有效楊氏模量2包含 81 個等間距縮進點的區(qū)域。然后將用于酶實驗的圓盤在等離子（400 mOsm / kg水）和高補（4000 mOsm / kg水）條件下進行機械預處理。此外，用于交聯(lián)實驗的圓盤經(jīng)歷了次強直（100 mOsm / kg水）條件。此后，將酶促樣品在37oC下在II型膠原酶（0.5μM，Worthington生化公司）中孵育1小時，其相應的滲透壓具有足夠的Ca供應。處理后，將樣品重新平衡（400 mOsm / kg水和4°C）1小時，并在與初始步驟相同的區(qū)域進行微壓痕。平均有效楊氏模量的相對差異被用作產(chǎn)生膠原裂解并降低剛度的化學活性的指示（膠原酶II型）或產(chǎn)生交聯(lián)和增加的剛度（L-threose）。此外，在L-threose中孵育后樣品的表面顏色被量化為非酶交聯(lián)效率的指示。++
結(jié)果：在高滲透壓條件下，用膠原酶II型處理的樣品的平均有效楊氏模量損失較低（圖1）。在所有組中，我們觀察到交聯(lián)過程的滲透壓依賴性趨勢（圖2）。滲透壓的增加與膠原纖維交聯(lián)的更高機會有關(guān)，如平均有效楊氏模量的變化所表明的那樣。此外，軟骨表面的顏色分析證實了隨著滲透壓的增加，交聯(lián)的增加，即向深黃色發(fā)展（圖3）。
結(jié)論：化學反應被認為是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)幾種類型的膠原纖維改變的原因，即OA中發(fā)生的酶裂解和衰老中發(fā)生的晚期糖化或非酶交聯(lián)。減少這些糖基化反應的一種方法是增強膠原纖維中的前應力，這可以通過外部浴中的低滲透壓或增加蛋白聚糖含量來實現(xiàn)。在目前的研究中，我們表明膠原纖維預應力在控制細菌膠原酶誘導的降解方面也起作用，盡管與糖基化過程相比，這是相反的。然而，滲透壓（即膠原纖維預應力）對MMPs酶活性的影響尚未作為本研究的補充進行研究。因此，宏觀尺度上的機械力可以極大地影響關(guān)節(jié)軟骨中膠原纖維內(nèi)的分子過程，這可能提供潛在的策略來限制它們，從而延長關(guān)節(jié)軟骨的功能壽命。
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